Cell Death Dis︱徐小燕团队揭示RNA编辑型AZIN1促进结肠癌血管生成的新机制
撰文︱张皓婉
责编︱王思珍
RNA编辑是哺乳动物中一种常见的转录后核苷酸修饰机制，由RNA特异性腺苷脱氨酶催化。RNA编辑既扩大了转录组的多样性，也丰富了蛋白质组的多样性[1]。最普遍的RNA编辑形式是通过腺嘌呤C6位点的水解脱氨作用，将腺苷转化为肌苷（A-to-I）。A到I的RNA编辑与临床密切相关：AZIN1[2]、COG3[3]和COPA[1]的编辑事件影响肿瘤细胞的生长和迁移，其功能与体细胞突变类似。因此阐明A到I的RNA编辑在癌症中发生蛋白质异质性的分子机制十分必要，有助于探索预后和治疗策略。
抗酶抑制因子1（antizyme inhibitor 1，AZIN1）在多种癌症类型中是最常见的发生A到I 的RNA编辑基因之一，如肝细胞癌[2]、非小细胞肺癌[4]、结直肠癌[5]。RNA编辑型AZIN1具有与侵袭性肿瘤行为相关的功能获得表型[2,5]，并促进鸟氨酸脱羧酶（ornithine decarboxylase）和聚胺积累[2]。最近研究表明AZIN1的A到I的RNA编辑与肿瘤发生和肿瘤侵袭行为密切相关。肿瘤血管生成在肿瘤发生和进展中起着重要作用，肿瘤血管生成是由促血管生成因子和抗血管生成细胞因子之间的平衡被打破引起的。目前对RNA编辑型AZIN1的研究主要集中在肿瘤细胞中的作用而非肿瘤微环境，尤其在肿瘤血管生成中的生物学功能尚未阐明。
2022年4月2日，中国医科大学基础医学院的徐小燕教授团队在Cell Death and Disease上发表了题为“A novel mechanism for A-to-I RNA-edited AZIN1 in promoting tumor angiogenesis in colorectal cancer”的研究论文，发现RNA编辑型AZIN1通过OAZ2介导的非泛素依赖性蛋白酶体途径延缓c-Myc降解，从而上调血管生成因子IL-8的分泌促进结直肠癌血管生成；并提示应用小分子拮抗剂如Reparixin阻断IL-8信号可能成为治疗发生高编辑的癌症患者的一种新策略。
为了探索RNA编辑型AZIN1在结肠癌中血管生成的生物学功能，作者应用HCT 116和HT-29两株结肠癌细胞系，将带有V5标签的野生型AZIN1和编辑型AZIN1_S367G的 cDNAs导入细胞中，并通过RT-qPCR、指纹印记分析和western blot结果证实外源导入编辑型AZIN1表达水平与野生型AZIN1相似（图1B,C）。
图1 编辑型AZIN1在结直肠癌细胞系中的验证
（图源：Y Wei, et al., Cell Death Dis, 2022）
接下来，作者从结肠癌细胞中提取条件培养基（CM）与HUVEC共培养，通过迁移实验、划痕实验和成管实验来探讨过表达RNA编辑型AZIN1是否会影响肿瘤血管生成。作者发现，与野生型AZIN1相比，过表达编辑型AZIN1_S367G结肠癌细胞的条件培养基显著增加迁移的细胞数量、伤口愈合率以及管腔所占面积百分比、连接点总数和血管总长度（图2）。这些结果表明过表达编辑型AZIN1在体外实验中诱导HUVEC的迁移和血管形成。
图2 过表达编辑型AZIN1的结直肠癌细胞的条件培养基对HUVEC的功能影响
（图源：Y Wei, et al., Cell Death Dis, 2022）
然后作者通过异种移植实验，使用过表达AZIN1的HCT 116结肠癌细胞和HUVEC注射到裸鼠皮下，来评估编辑型AZIN1在小鼠体内对结肠癌发生发展的作用，以及是否与体外实验的发现一致。结果表明无论是否混合HUVEC，过表达编辑型AZIN1的HCT 116组的肿瘤体积都大于对照组和野生型AZIN1组的肿瘤体积（图3A, B）。此外，与对照组和WT组相比，micro-CT扫描结果提示编辑型AZIN1-HCT 116组的肿瘤血管密度显著增加（图3C）。这些数据与体外实验结果一致，表明编辑型AZIN1促进肿瘤中的血管生成。
图3 编辑型AZIN1在体内促进肿瘤血管生成
（图源：Y Wei, et al., Cell Death Dis, 2022）
为了探索编辑型AZIN1促进肿瘤血管生成的机制，作者应用血管生成蛋白芯片分析编辑型AZIN1的结肠癌细胞释放的血管生成细胞因子。作者发现与AZIN1野生组相比，AZIN1编辑组条件培养基中IL-8水平增加（图4A），而与HUVEC共培养后的条件培养基中IL-8显著降低（图4B）。ELISA检测结果显示AZIN1编辑组条件培养基比AZIN1野生组中IL-8显著上调（图4C）。这些结果表明编辑型AZIN1可能部分通过促进血管生成因子IL-8的分泌诱导血管生成。
此外，生信分析表明与癌旁组织相比，IL-8（也称为CXCL8）mRNA表达在结肠癌中更高（图4D,E）。为了研究IL-8在结肠癌中的血管生成相关功能，作者进行GSEA分析。与对照组相比，IL-8正相关基因显著富集在血管生成通路（图4F,G）。同样，相关分析表明血管生成相关基因与IL-8显著相关（图4H）。这些数据提示IL-8与结肠癌的血管生成密切相关。
图4 AZIN1编辑组与野生组分泌的差异因子
（图源：Y Wei, et al., Cell Death Dis, 2022）
为了进一步验证RNA编辑型AZIN1是否通过上调IL-8促进肿瘤血管生成，作者将IL-8 shRNA#1和IL-8 shRNA #2导入过表达编辑型AZIN1的HCT 116细胞，从而下调IL-8的表达水平（图5A）。提取各组条件培养基培养HUVEC细胞。作者发现下调IL-8后抑制HUVEC的迁移和成管。此外，添加重组蛋白IL-8可轻微回复血管形成，显著增加HUVEC的迁移（图5B,C）同样，Reparixin作为IL-8受体CXCR1和CXCR2激活的抑制剂，可阻断IL-8的促血管生成作用（图5D,E）。这些结果支持编辑型AZIN1通过提高IL-8的分泌诱导肿瘤血管生成。
图5 下调IL8抑制HUVEC迁移和成管
（图源：Y Wei, et al., Cell Death Dis, 2022）
接着，为了评估RNA编辑型AZIN1和IL-8在结肠癌发生发展中的关系，作者进行异种移植实验，使用过表达编辑型AZIN1的HCT 116细胞转染IL-8 shRNA#1或阴性对照来证实体外结果。结果显示无论是否混合HUVEC细胞, IL-8敲减组的肿瘤大小均低于阴性对照组（图6A,B,D,E）。为了促进临床应用的可能性，作者应用抑制药物Reparixin治疗荷瘤小鼠。与PBS注射组相比, 药物Reparixin明显抑制肿瘤的生长（图6D,E）。更重要的是，对肿瘤组织进行CD31免疫组化染色发现与对照组相比，IL-8敲减组和Reparixin治疗组的肿瘤中微血管数量均明显降低（图6C, F）。这些数据表明下调IL8抑制肿瘤生长和肿瘤血管生成，靶向IL8可能成为发生AZIN1高编辑的结肠癌患者的新治疗策略。
图6 靶向IL-8在体内抑制肿瘤血管生成
（图源：Y Wei, et al., Cell Death Dis, 2022）
与蛋白表达水平一致，编辑型AZIN1组IL-8 mRNA水平高于野生型AZIN1组和对照组（图7A）。然而，编辑型AZIN1促进IL8分泌的机制尚不明确。已有研究表明c-Myc是IL-8的转录因子[6]。并且与野生型AZIN1组相比，过表达编辑型AZIN1的HCT 116中c-Myc蛋白表达增加（图7B）。此外，编辑型AZIN1显著促进血清刺激后c-Myc的表达（图7D）。之前的研究表明RNA编辑型AZIN1通过抑制抗酶介导的肿瘤相关蛋白降解，如鸟氨酸脱羧酶和cyclin D1，促进肿瘤细胞增殖和肿瘤进展[2]。于是，作者推测编辑型AZIN1是否通过延缓c-Myc降解从而促进IL-8分泌，并应用环己酰亚胺追踪实验来验证猜想。用环己酰亚胺（CHX）处理三组细胞，导致c-Myc蛋白表达呈时间依赖性下降。有趣的是，在编辑型AZIN1组中，c-Myc的半衰期比野生组延长（图7E）。以上结果表明RNA编辑型AZIN1延缓c-Myc的降解，从而促进IL-8的转录，提高IL-8的mRNA水平以及蛋白表达。
图7 编辑型AZIN1通过OAZ2介导非泛素化蛋白酶体降解途径延缓c-Myc的降解
（图源：Y Wei, et al., Cell Death Dis, 2022）
为了探索编辑型AZIN1延缓c-Myc降解的机制，作者分别采用蛋白酶体抑制剂MG132和E1泛素激活酶的抑制剂PYR41[7]预处理三组细胞6 h后，再用CHX处理。在MG132阻断蛋白酶体降解途径后，三组c-Myc蛋白降解速度均较单用CHX处理有所减缓，尤其是在CHX处理30 min时（图7F）。说明c-Myc的蛋白降解途径包括蛋白酶体降解途径和非蛋白酶体降解途径。与野生组相比，编辑组延迟c-Myc蛋白降解在非蛋白酶体途径方面的表现没有明显优势，编辑组的降解速度略快于野生组（图7F）。然后，进一步研究编辑型AZIN1如何通过蛋白酶体途径延缓c-Myc降解。在PYR41阻断泛素化蛋白酶体降解途径后，与野生组相比，编辑组明显延缓c-Myc的降解（图7G），表明编辑型AZIN1通过非泛素依赖蛋白酶体降解途径延缓c-Myc的降解。此外，由于AZIN1可以与OAZ2结合[8]，并且OAZ2可以介导c-Myc非泛素依赖的蛋白酶体降解途径[9]，作者因此引入OAZ2来探索OAZ2是否在这一过程中发挥作用。外源性过表达OAZ2（图7C）和PYR41处理后，c-Myc的降解速率明显延迟，甚至编辑组c-Myc的表达较野生组略有提高（图7H），表明编辑型AZIN1可以通过OAZ2在非泛素依赖的蛋白酶体途径中延缓c-Myc降解。上述结果提示：编辑型AZIN1在一定程度上延缓OAZ2介导的非泛素依赖的蛋白酶体途径对c-Myc的降解，从而促进IL-8转录，进而上调IL-8的mRNA水平和蛋白表达。
图8 编辑型AZIN1促进肿瘤血管生成的机制
（图源：Y Wei, et al., Cell Death Dis, 2022）
综上所述，该研究首次探索A到I的RNA编辑型AZIN1对肿瘤血管生成的作用，通过体外和体内实验发现RNA编辑型AZIN1主要通过上调血管生成因子IL-8来促进肿瘤的血管生成。并且首次阐释RNA编辑型AZIN1对已知的IL-8转录因子c-Myc的调控，证实RNA编辑型AZIN1通过OAZ2介导的非泛素依赖性蛋白酶体途径延缓c-Myc降解,从而有助于提高血管生成因子IL-8的mRNA水平和蛋白分泌（图8）。已有研究表明直接抑制c-Myc可以导致荷瘤小鼠的瘤体快速消退，是一种可能的治疗方案[10]，这里研究者认为靶向IL-8也可能是一种更精确合理的抑制肿瘤血管生成的策略。基于该研究中应用小分子拮抗剂Reparixin阻断IL-8信号可以抑制肿瘤血管生成，可能为检测到高编辑事件的人类癌症患者提供新的治疗策略。
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41419-022-04734-8
中国医科大学基础医学院的徐小燕教授为论文的通讯作者，魏艳、博士研究生张皓婉、冯乔慧为该论文的共同第一作者。上述研究工作得到了国家自然科学基金、辽宁省优秀青年基金等资助。徐小燕教授团队长期致力于表观遗传学调控与癌症等重大疾病的研究，取得了一系列具有重要科学价值和广阔应用前景的成果。研究成果发表在Cancer Cell、The Journal of Clinical Investigation、Genome Research等国际著名期刊。
魏艳（左一），张皓婉（左二），冯乔慧(右二)，徐小燕（右一）。
（照片提供自：中国医科大学徐小燕实验室）
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制版︱王思珍
本文完